小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞（PECs）是肺部血管的關(guān)鍵組成部分，對(duì)肺循環(huán)的穩(wěn)定和氣體交換功能具有重要作用。研究肺血管內(nèi)皮細(xì)胞有助于了解肺部疾病的機(jī)制，如肺動(dòng)脈高壓、肺水腫及其它血管相關(guān)疾病。本文簡(jiǎn)要介紹了小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)方法。

　　一、材料與設(shè)備

　　1.動(dòng)物模型：健康C57BL/6小鼠（8-12周齡，雄性或雌性均可）

　　2.細(xì)胞培養(yǎng)基：EndothelialCellMedium（ECM），或含有10%胎牛血清（FBS）、1%抗生素（青霉素/鏈霉素）的DMEM/F-12混合培養(yǎng)基

　　3.試劑與工：胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）、含膠原酶和DNA酶的消化液、離心管、培養(yǎng)皿、無(wú)菌操作臺(tái)

　　二、小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離步驟

　　1.動(dòng)物麻醉與處死：使用異氟烷麻醉小鼠，通過(guò)頸部脫臼處死。之后迅速將小鼠胸腔暴露，并剪開(kāi)胸腔，暴露出雙側(cè)肺臟。

　　2.肺臟灌注：在肺動(dòng)脈處插入針頭，通過(guò)心臟將1×PBS緩沖液注入肺臟，進(jìn)行灌注清洗，去除肺臟表面的血液。此步驟有助于減少血液中的紅細(xì)胞對(duì)細(xì)胞分離的干擾。

　　3.肺組織消化：將灌注清洗后的肺組織剪碎，放入含有膠原酶（1mg/mL）和DNA酶（20U/mL）的消化液中，37℃下消化30-45分鐘。消化過(guò)程中輕輕吹打以促進(jìn)組織分解。

　　4.細(xì)胞過(guò)濾與收集：消化后，將細(xì)胞懸液通過(guò)70μm細(xì)胞過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾，去除未完全消化的組織塊。收集濾液，加入PBS進(jìn)行多次離心洗滌（500×g，5分鐘），去除消化液和雜質(zhì)。

　　5.細(xì)胞培養(yǎng)：將分離得到的細(xì)胞重新懸浮在培養(yǎng)基中，并接種于培養(yǎng)皿（T25或更大培養(yǎng)瓶）。使用含10%FBS的ECM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　三、小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定

　　1.形態(tài)觀察：在培養(yǎng)初期，血管內(nèi)皮細(xì)胞呈典型的多角形或長(zhǎng)梭形，生長(zhǎng)為單層鋪展的細(xì)胞。

　　2.免疫熒光染色：使用血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物進(jìn)行鑒定，如抗-CD31、抗-VE-cadherin、抗-vWF抗體。通過(guò)免疫熒光染色和顯微鏡觀察，驗(yàn)證細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。

　　3.功能鑒定：細(xì)胞形成的血管樣結(jié)構(gòu)、白細(xì)胞黏附、流動(dòng)性測(cè)試等也可作為功能鑒定方法。

　　四、培養(yǎng)注意事項(xiàng)

　　1.培養(yǎng)環(huán)境：維持細(xì)胞在37℃、5%CO?環(huán)境下生長(zhǎng)。定期更換培養(yǎng)基，通常每2-3天一次，確保細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供給。

　　2.細(xì)胞傳代：當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，可用0.25%胰蛋白酶處理進(jìn)行傳代。傳代時(shí)應(yīng)盡量避免過(guò)度操作，保持細(xì)胞的良好狀態(tài)。

　　3.污染控制：在整個(gè)操作過(guò)程中，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止細(xì)菌、真菌等污染，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

　　小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)技術(shù)是研究肺血管生理及病理的基礎(chǔ)方法。通過(guò)適當(dāng)?shù)墓嘧ⅰ⑾图?xì)胞分離手段，可以獲得純度較高的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，為相關(guān)疾病模型的建立及藥物篩選提供了重要的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。在實(shí)際應(yīng)用中，細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境和操作細(xì)節(jié)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要，需謹(jǐn)慎操作與優(yōu)化。